Техника проведения иммуноферментного анализа

В лунки планшета вносят по 1 ОО мкл раствора антигенов (модифици­рованного ацетальдегидом или не модифицированного альбумина) с кон - центрацией белка 2,8 мкг в 1 мл 0,05М. карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5. Сорбцию осуществляют в течение 18 — 20 часов при температуре 20—22°С, после чего не связавшиеся с планььтетом антигены трижды отмывают холодной водопроводной водой и еще трижды - забуфереп­ным фосфатами физиологическим раствором с рН 7,2 — 7,4, содержащим 0,05 СУ<> твина-20 (ЗФР/Т).

Далее в лунки вносят по 1 ОО мкл исследуе­мой сыворотки крови в последовательном двукратном разведении, при­готовленном на ЗФР/Т. После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты о т м ы в а ю т по описанной выше методике и в лунки вносят по 1 ОО мкл иммунопероксидазного реагента, представляющего собой анти­тела к иммуноглобулинам человека класса А, меченные пероксидазой хрена. Рабочее разведение реагента должно быть» подобрано в предварительном эксперименте.

Конъюгат разводят ЗФР/Т. Инкубацию планшетов осуществляют в течение 1 часа при 37°С, после чего конъю - гат о т м ы в а ю т 1 О раз водопроводной водой и еще три раза - 3<ЭЕ>Р/Т. Иммунологическое взаимодействие компонентов выявляют внесением в лунки по 1 ОО мкл субстратной смеси, для приготовления которой ис­пользуют ортофенилендиамин (8 мг ортофенилендиамина в 20 мл цит­рат но-фосфатного буфера с рН 5,0 с добавлением 8 мкл ЗО перекиси водорода).

Инкубацию проводят в течение ЗО минут при температуре 20—22° в темноте, после чего дальнейшее развитие окраски ингибируют добавлением 50 мкл 1 О <> серной кислоты.

Учет результатов исследования

Результаты учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Учет результатов осуществляют исходя из разности величин оптической плотности, выявляемых при взаимодействии исследуемой сыворотки крови с модифицированным ацетальдегидом и не модифици­рованным альбумином. За титр сыворотки принимается величина, об­ратная разведению сыворотки, при котором разность величин оптической плотности оказывается не меньше О, 1 .

Обоснование подхода, использованного При учете результатов

В Таблице 1 Представлены усредненные результаты обследования 12 умеренно пьющих людей и 12 больных алкоголизмом.

С помощью им-муноферментного анализа в сыворотках крови обследованных выявляли иммуноглобулины класса А к ацетальдегидному альбуминовому аддукту (ЧСА-А) и к неизмененному сывороточному альбумину человека (ЧСА). Очевидно, что при одном и том же разведении сывороток оптическая плот­ность (ОП), обнаруживаемая на конечном этапе иммуноферментного ана­лиза, при выявлении антител к ацетальдегидному аддукту, превышает ана-логичный показатель, обнаруживаемый при выявлении антител к не модифицированному белку. Это и понятно, поскольку с ацетальдегид - ным аддуктом взаимодействуют не только антитела к: неизмененному бел­ку, но и антитела к модифицированному ацетальдегидом альбумину.

Таким образом, можно полагать, что выявляемая разница значений оптической плотности (Аоп) объясняется наличием антител к структурно измененному под воздействием ацетальдегида альбумину, а величина Аоп отражает концентрацию этих антител в исследуемой сыво­ротке крови. Анализ полученных результатов показал (таблица 1), что в том слу­чае, когда величина Аоп приближается к О, 1, но не опускается ниже этого значения, различие величин оптической плотности, обнаруживаемых при выявлении антител к а це т ал ьд е ги д н ому аддукту и к не модифицированному белку является еще статистически достоверным. Поэтому за титр сыворот­ки была принята величина, обратная такому ее максимальному разведе­нию, при котором значение Доп было не менее 0,1 .

Выявляемые таким образом антитела в дальнейшем мы будем называть антителами к белкам, структурно измененным воздействием ацетальдегида. Тех Буь ища 1 Оптическая плотность (ОП), обнаруживаемая Ш Иммуноферментном анализе при взаимодействии сывороток крови умеренно пжжош. их лиц и больных алкоголизмом с модифицированным ацетальдегидом (ЧСА-А) и немодис|эигхированным (ЧСА) сывороточным Альбумином человека

Обследуе­ мая группа В ыя вляе мые пар аметр ы Разведение сывоооток
1 : 8 1 : 16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 1 : 256 1 : 512
Больные Ал ко голиз - мом Ог 12) AT к ЧСА-А 1,025 0,771 О,Вот 0,422 0,313 0,15 1 0,105
AT к ЧСА 0,625 0,457 0,392 0,298 0,232 О, 125 0,080
/\ ОГТ 0,398 О, зю 0,216 ОД21 0,079 0,027 0,020
0,001 0,001 0,002 0,05 Н. д. Н. д. Н. д.
Умеренно пьющие лица &163;п 12) AT к ЧСА-А 0,450 0,352 0,250 0,168 0,098 0,074 0,054
AT к ЧСА 0,268 0,219 О, 177 0,130 0,074 0,048 0,034
ОГТ 0Д80 Одзо 0,071 О, озо 0,023 0,020 0,019
0,05 0,05 Н. д. Н. д. Н. д. Н. д. Н. д.

Разность величин оптических плотностей, обнаруживаемых при выявлении ан­тител к модифицированному ацетальдегидом (AT к ЧСА-А) и немодифицированному альбумину (AT к ЧСА) в сыворотке крови при одном и том же ее разведении. Достоверность различи я средних величин оптической плотности при выявле­нии антител к модифицированному ацетальдегидом и немодифицированному альбу­мину в одних и тех же разведениях исследуемой сыворотки крови. н. д. — различие недостоверно.

Похожие записи:

Категории: