В лунки планшета вносят по 1 ОО мкл раствора антигенов (модифици­рованного ацетальдегидом или не модифицированного альбумина) с кон – центрацией белка 2,8 мкг в 1 мл 0,05М. карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5. Сорбцию осуществляют в течение 18 — 20 часов при температуре 20—22°С, после чего не связавшиеся с планььтетом антигены трижды отмывают холодной водопроводной водой и еще трижды – забуфереп­ным фосфатами физиологическим раствором с рН 7,2 — 7,4, содержащим 0,05 СУ<> твина-20 (ЗФР/Т).

Далее в лунки вносят по 1 ОО мкл исследуе­мой сыворотки крови в последовательном двукратном разведении, при­готовленном на ЗФР/Т. После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты о т м ы в а ю т по описанной выше методике и в лунки вносят по 1 ОО мкл иммунопероксидазного реагента, представляющего собой анти­тела к иммуноглобулинам человека класса А, меченные пероксидазой хрена. Рабочее разведение реагента должно быть» подобрано в предварительном эксперименте.

Конъюгат разводят ЗФР/Т. Инкубацию планшетов осуществляют в течение 1 часа при 37°С, после чего конъю – гат о т м ы в а ю т 1 О раз водопроводной водой и еще три раза – 3<ЭЕ>Р/Т. Иммунологическое взаимодействие компонентов выявляют внесением в лунки по 1 ОО мкл субстратной смеси, для приготовления которой ис­пользуют ортофенилендиамин (8 мг ортофенилендиамина в 20 мл цит­рат но-фосфатного буфера с рН 5,0 с добавлением 8 мкл ЗО перекиси водорода).

Инкубацию проводят в течение ЗО минут при температуре 20—22° в темноте, после чего дальнейшее развитие окраски ингибируют добавлением 50 мкл 1 О <> серной кислоты.

Учет результатов исследования

Результаты учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Учет результатов осуществляют исходя из разности величин оптической плотности, выявляемых при взаимодействии исследуемой сыворотки крови с модифицированным ацетальдегидом и не модифици­рованным альбумином. За титр сыворотки принимается величина, об­ратная разведению сыворотки, при котором разность величин оптической плотности оказывается не меньше О, 1 .

Обоснование подхода, использованного При учете результатов

В Таблице 1 Представлены усредненные результаты обследования 12 умеренно пьющих людей и 12 больных алкоголизмом.

С помощью им-муноферментного анализа в сыворотках крови обследованных выявляли иммуноглобулины класса А к ацетальдегидному альбуминовому аддукту (ЧСА-А) и к неизмененному сывороточному альбумину человека (ЧСА). Очевидно, что при одном и том же разведении сывороток оптическая плот­ность (ОП), обнаруживаемая на конечном этапе иммуноферментного ана­лиза, при выявлении антител к ацетальдегидному аддукту, превышает ана-логичный показатель, обнаруживаемый при выявлении антител к не модифицированному белку. Это и понятно, поскольку с ацетальдегид – ным аддуктом взаимодействуют не только антитела к: неизмененному бел­ку, но и антитела к модифицированному ацетальдегидом альбумину.

Таким образом, можно полагать, что выявляемая разница значений оптической плотности (Аоп) объясняется наличием антител к структурно измененному под воздействием ацетальдегида альбумину, а величина Аоп отражает концентрацию этих антител в исследуемой сыво­ротке крови. Анализ полученных результатов показал (таблица 1), что в том слу­чае, когда величина Аоп приближается к О, 1, но не опускается ниже этого значения, различие величин оптической плотности, обнаруживаемых при выявлении антител к а це т ал ьд е ги д н ому аддукту и к не модифицированному белку является еще статистически достоверным. Поэтому за титр сыворот­ки была принята величина, обратная такому ее максимальному разведе­нию, при котором значение Доп было не менее 0,1 .

Выявляемые таким образом антитела в дальнейшем мы будем называть антителами к белкам, структурно измененным воздействием ацетальдегида. Тех Буь ища 1 Оптическая плотность (ОП), обнаруживаемая Ш Иммуноферментном анализе при взаимодействии сывороток крови умеренно пжжош. их лиц и больных алкоголизмом с модифицированным ацетальдегидом (ЧСА-А) и немодис|эигхированным (ЧСА) сывороточным Альбумином человека

Обследуе­ мая группа	В ыя вляе мые пар аметр ы	Разведение сывоооток
1 : 8	1 : 16	1 : 32	1 : 64	1 : 128	1 : 256	1 : 512
Больные Ал ко голиз – мом Ог 12)	AT к ЧСА-А	1,025	0,771	О,Вот	0,422	0,313	0,15 1	0,105
AT к ЧСА	0,625	0,457	0,392	0,298	0,232	О, 125	0,080
/\ ОГТ	0,398	О, зю	0,216	ОД21	0,079	0,027	0,020
0,001	0,001	0,002	0,05	Н. д.	Н. д.	Н. д.
Умеренно пьющие лица &163;п 12)	AT к ЧСА-А	0,450	0,352	0,250	0,168	0,098	0,074	0,054
AT к ЧСА	0,268	0,219	О, 177	0,130	0,074	0,048	0,034
/Ч ОГТ	0Д80	Одзо	0,071	О, озо	0,023	0,020	0,019
0,05	0,05	Н. д.	Н. д.	Н. д.	Н. д.	Н. д.

Разность величин оптических плотностей, обнаруживаемых при выявлении ан­тител к модифицированному ацетальдегидом (AT к ЧСА-А) и немодифицированному альбумину (AT к ЧСА) в сыворотке крови при одном и том же ее разведении. Достоверность различи я средних величин оптической плотности при выявле­нии антител к модифицированному ацетальдегидом и немодифицированному альбу­мину в одних и тех же разведениях исследуемой сыворотки крови. н. д. — различие недостоверно.