В лунки планшета вносят по 1 ОО мкл раствора антигенов (модифицированного ацетальдегидом или не модифицированного альбумина) с кон - центрацией белка 2,8 мкг в 1 мл 0,05М. карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,5. Сорбцию осуществляют в течение 18 — 20 часов при температуре 20—22°С, после чего не связавшиеся с планььтетом антигены трижды отмывают холодной водопроводной водой и еще трижды - забуферепным фосфатами физиологическим раствором с рН 7,2 — 7,4, содержащим 0,05 СУ<> твина-20 (ЗФР/Т).
Далее в лунки вносят по 1 ОО мкл исследуемой сыворотки крови в последовательном двукратном разведении, приготовленном на ЗФР/Т. После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты о т м ы в а ю т по описанной выше методике и в лунки вносят по 1 ОО мкл иммунопероксидазного реагента, представляющего собой антитела к иммуноглобулинам человека класса А, меченные пероксидазой хрена. Рабочее разведение реагента должно быть» подобрано в предварительном эксперименте.
Конъюгат разводят ЗФР/Т. Инкубацию планшетов осуществляют в течение 1 часа при 37°С, после чего конъю - гат о т м ы в а ю т 1 О раз водопроводной водой и еще три раза - 3<ЭЕ>Р/Т. Иммунологическое взаимодействие компонентов выявляют внесением в лунки по 1 ОО мкл субстратной смеси, для приготовления которой используют ортофенилендиамин (8 мг ортофенилендиамина в 20 мл цитрат но-фосфатного буфера с рН 5,0 с добавлением 8 мкл ЗО перекиси водорода).
Инкубацию проводят в течение ЗО минут при температуре 20—22° в темноте, после чего дальнейшее развитие окраски ингибируют добавлением 50 мкл 1 О <> серной кислоты.
Учет результатов исследования
Результаты учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Учет результатов осуществляют исходя из разности величин оптической плотности, выявляемых при взаимодействии исследуемой сыворотки крови с модифицированным ацетальдегидом и не модифицированным альбумином. За титр сыворотки принимается величина, обратная разведению сыворотки, при котором разность величин оптической плотности оказывается не меньше О, 1 .
Обоснование подхода, использованного При учете результатов
В Таблице 1 Представлены усредненные результаты обследования 12 умеренно пьющих людей и 12 больных алкоголизмом.
С помощью им-муноферментного анализа в сыворотках крови обследованных выявляли иммуноглобулины класса А к ацетальдегидному альбуминовому аддукту (ЧСА-А) и к неизмененному сывороточному альбумину человека (ЧСА). Очевидно, что при одном и том же разведении сывороток оптическая плотность (ОП), обнаруживаемая на конечном этапе иммуноферментного анализа, при выявлении антител к ацетальдегидному аддукту, превышает ана-логичный показатель, обнаруживаемый при выявлении антител к не модифицированному белку. Это и понятно, поскольку с ацетальдегид - ным аддуктом взаимодействуют не только антитела к: неизмененному белку, но и антитела к модифицированному ацетальдегидом альбумину.
Таким образом, можно полагать, что выявляемая разница значений оптической плотности (Аоп) объясняется наличием антител к структурно измененному под воздействием ацетальдегида альбумину, а величина Аоп отражает концентрацию этих антител в исследуемой сыворотке крови. Анализ полученных результатов показал (таблица 1), что в том случае, когда величина Аоп приближается к О, 1, но не опускается ниже этого значения, различие величин оптической плотности, обнаруживаемых при выявлении антител к а це т ал ьд е ги д н ому аддукту и к не модифицированному белку является еще статистически достоверным. Поэтому за титр сыворотки была принята величина, обратная такому ее максимальному разведению, при котором значение Доп было не менее 0,1 .
Выявляемые таким образом антитела в дальнейшем мы будем называть антителами к белкам, структурно измененным воздействием ацетальдегида. Тех Буь ища 1 Оптическая плотность (ОП), обнаруживаемая Ш Иммуноферментном анализе при взаимодействии сывороток крови умеренно пжжош. их лиц и больных алкоголизмом с модифицированным ацетальдегидом (ЧСА-А) и немодис|эигхированным (ЧСА) сывороточным Альбумином человека
Обследуе мая группа | В ыя вляе мые пар аметр ы | Разведение сывоооток | ||||||
1 : 8 | 1 : 16 | 1 : 32 | 1 : 64 | 1 : 128 | 1 : 256 | 1 : 512 | ||
Больные Ал ко голиз - мом Ог 12) | AT к ЧСА-А | 1,025 | 0,771 | О,Вот | 0,422 | 0,313 | 0,15 1 | 0,105 |
AT к ЧСА | 0,625 | 0,457 | 0,392 | 0,298 | 0,232 | О, 125 | 0,080 | |
/\ ОГТ | 0,398 | О, зю | 0,216 | ОД21 | 0,079 | 0,027 | 0,020 | |
0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,05 | Н. д. | Н. д. | Н. д. | ||
Умеренно пьющие лица &163;п 12) | AT к ЧСА-А | 0,450 | 0,352 | 0,250 | 0,168 | 0,098 | 0,074 | 0,054 |
AT к ЧСА | 0,268 | 0,219 | О, 177 | 0,130 | 0,074 | 0,048 | 0,034 | |
/Ч ОГТ | 0Д80 | Одзо | 0,071 | О, озо | 0,023 | 0,020 | 0,019 | |
0,05 | 0,05 | Н. д. | Н. д. | Н. д. | Н. д. | Н. д. |
Разность величин оптических плотностей, обнаруживаемых при выявлении антител к модифицированному ацетальдегидом (AT к ЧСА-А) и немодифицированному альбумину (AT к ЧСА) в сыворотке крови при одном и том же ее разведении. Достоверность различи я средних величин оптической плотности при выявлении антител к модифицированному ацетальдегидом и немодифицированному альбумину в одних и тех же разведениях исследуемой сыворотки крови. н. д. — различие недостоверно.