На первом этапе обследования больного необходимо провести долабораторную оценку иммунного статуса путем анкетирования. Больному задают ряд вопросов. Если хотя бы на один из них он отвечает положительно, это свидетельствует о тех или иных нарушениях в иммунной системе.
1. Частота инфекций. У взрослого человека с нормально функционирующей иммунной системой частота инфекций составляет не более 4 в год (для ребенка — не более 6).
2. Атипичная температурная реакция при наличии инфекции: отсутствие лихорадки (не наблюдается повышения температуры); немотивированная лихорадка или длительный субфебрилитет — более i 2 сут.
3. Затяжное течение любых заболеваний (более 3 нед).
4. Наличие у пациента любых хронических заболеваний.
5. Наличие у пациента любых аллергических реакций.
6. Аутоиммунные заболевания.
7. Онкопатология. Н, Аппсидо - и тонзиллэктомия. 9. Гасфо - и жтеропатии, диарея.
10. Гнойно-септические заболевания (флегмоны, абсцессы, парапроктит и т. П.) И. Повторные лимфоаденопатии.
12. Длительное применение цитостатиков, кортикостероидов, антибиотиков и др. Лекарственных средств, отрицательно влияющих на иммунную систему.
13. Наличие за последние 6 месяцев травм, ожогов, серьезных операций, стрессов.
По результатам анкетирования можно отдать предпочтение одному из следующих синдромов:
1. Инфекционный синдром — хронический субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии, рецидивирующие заболевания легких, частые ОРВИ, бактериальные поражения кожи, поражения ногтей, рецидивирующие конъюнктивиты, стоматит, кариес, рецидивирующий герпес, лимфоадениты. Дисбактериоз и генерализованная инфекция.
2. Аллергический синдром — аллергопораже-ния кожи и слизистых, дерматиты, экземы, аллергические риниты.
3. Аутоиммунный синдром — воспалительные процессы в опорно-двигательном аппарате, СКВ, склеродермия, гломерулонефрит, сахарный диабет, неврологические расстройства, склероз,
Стандарты Диагностики Вторичных Иммунодефицитов 567
Тиреошшт, аутоиммунные поражения печени, бесплодие, психопатические заболевания.
4. Лимфопролиферативный синдром ~- опухоли в лимфатической системе, лимфолейкоз, саркома Капоши, групповая гиперплазия лимфатических узлов, мононуклеоз и частые увеличения лимфатических узлов.
5. Вторичные иммунодефицита — все виды инфекционного синдрома с торпидным хроническим атипическим течением, гиперпигментация кожи, СПИД.
Если у больного обнаруживаются признаки одного или нескольких синдромов его включают в группу повышенного риска. Таким пациентам требуется помощь клинического иммунолога и иммунологической диагностической лаборатории для уточнения характера иммунных нарушений и обоснованного выбора иммунокорректирующей терапии.
На этапе клинического обследования больного используются все методы объективного, инструментального и лабораторного обследования, соответствующие характеристикам синдрома, обоснованного результатами анкетирования.
Особое внимание уделяется результатам клинического анализа крови, который содержит информацию о количестве циркулирующих в крови лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, т. Е. Основного арсенала клеток, участвующих в иммунном ответе и воспалительных реакциях.
При наличии у пациента клинических при_ знаков иммунодефицита необходимо провести лабораторное иммунологическое обследование, результаты которого сводятся в «иммунограмму».
При планировании лабораторного иммунологического обследования также исходят из наиболее вероятного характера иммунологических нарушений, свойственных каждому из вышеперечисленных синдромов.
Острый бронхитщепринятым объектом изучения являются наиболее доступные лейкоциты циркулирующей крови, которые включают в каждый отдельно взятый момент всего лишь 2 от всех лимфоцитов организма. Свойственное иммунной системе явление перманентной рециркуляции всех лимфоцитов организма дает основание использовать лимфоциты крови в качестве типичных представителей всех лимфоцитов организма. Однако следует учитывать, что лимфоциты, как и другие лейкоциты крови, недостаточно полно отражают изменения свойств клеток в очагах инфекции, воспаления, деструкции. В связи с этим желательно исследование лейкоцитов не только циркулирующей крови, но и других биологических жидкостей (ликвор, плевральная жидкость, асцитическая жидкость, бронхо-альвеолярный
Лаваж) или биоптатов пораженных органов и тканей.
Для выделения мононуклеаров крови лимфоцитов и моноцитов наиболее широкое распространение получил метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности. Среди выделенных клеток обычно 70—90 составляют лимфоциты, а на долю моноцитов приходится от 10 до 30. Использование моноклональных антител позволяет разделить моноциты и лимфоциты с помощью флуоресцентно активированного клеточного сортера (FACS). В случаях наиболее выраженного местного иммунного ответа лейкоциты могут быть выделены из мест локализации иммунного ответа или иммунного воспаления. Например, при ревматоидном артрите наиболее информативным считается изучение клеточного состава синовиальной жидкости пораженного сустава.
Наиболее точный и информативный современный метод идентификации лейкоцитов по их поверхностному фенотипу основан на выявлении и количественной оценке уровней экспрессии на мембранах лейкоцитов поверхностных маркеров-антигенов с помощью соответствующих моноклональных антител и метода проточной цитофлюориметрии. Острый бронхитычный набор изучаемых поверхностных маркеров включает молекулы: CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD16, CD56,
СВ25,Н1А-окидр.
Проточный цитофлюориметр ГС»- Воляет изучить очень большое количество клеток и объективно отразить количественные характеристики процентного содержания разных клеток, несущих на поверхности определенные молекулы (табл. 48, 49). Таким методом оценивают поверхностный фенотип лейкоцитов включая экспрессию основных рецепторов, корецепторов, кос-тимулирующих и адгезионных молекул и других антигенов.
В норме у взрослых около 70 л+имфоцитов крови составляютт-лимфо1гиты (CD3+), среди которых соотношение С04+/СВ8+составляет 1,5-2,0. Остальные 30 приходятся на В-лимфоциты (CD19, CD20) и NK (CD16, CD56).
Изучение поверхностного фенотипа лимфоцитов позволяет определить соотношения субпопуляций Т-лимфоцитов, соотношения наивных клеток и клеток памяти, переход клеток в активированное состояние (CD25f, HLA-DR+).
В дополнение к изучению поверхностного фенотипа проточная флюориметрия позволяет выявлять некоторые молекулы в цитоплазме клеток, предварительно обработанных для повышения проницаемости их поверхностной мембраны. В цитоплазме лейкоцитов с помощью этого метода
568 Часть 9. Патология иммунной системы
Таблица 48
Границы нфмальных значений относительного и абсолютного количества лейкоцитов крови, несущих схответствующие поверхностные маркеры у взрослых (по данным ведущих иммунологических лабораторий Санкт - Петербурга, Стандартизация. ..19 99)
Опосредованного иммунитета. Наиболее распространенными коммерческими антигенами для постановки кожных проб ГЗТ являются: туберкулин, дифтерийный и столбнячный анатоксины, кандидозный и некоторые другие антигены. Правильный учет результатов кожной пробы ГЗТ основывается на тщательном измерении диаметра зоны уплотнения (а не покраснения) через 24 и 48 ч после внутрикожного введения антигена. Положительной считается пробронхиальная астма в случае, если сумма двух взаимно перпендикулярных диаметров зоны уплотнения превосходит 5 мм. Примерно у 85 здоровых взрослых реакция с одним или несколькими антигенами бывает положительной. Положительная кожная пробронхиальная астма со столбнячным анатоксином бывает у 97 детей после третьей иммунизации вакциной АДС. Проявление положительной реакции вместо отрицательной в динамике наблюдения расценивается как «вираж». Положительная реакция при проведении кожных проб позволяет исключить тяжелую недостаточность клеточного иммунитета, а отрицательные результаты реакции не имеют самостоятельного диагностического значения, так как отрицательная реакция может быть следствием отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном.
Для непосредственной оценки функциональной активности Т-лимфоцитов, как правило, оценивают спонтанную пролиферацию лимфоцитов и ответ усилением пролиферации на действие митогенов или антигенов. Предпочтение отдается использованию поликлональных митогенов, так как в общей массе лимфоцитов доля лимфоцитов, способных ответить на конкретный антиген, слишком мала. В качестве поликлональных мито-генов используют эмпирически найденные вещества, способные индуцировать пролиферацию всех или большинства Т-лимфоцитов. В качестве мито-генов Т-лимфоцитов обычно используют фитоге-магглютинин (ФГА) или конканавалин А (кона).
В качестве эффекторных функций Т-лим-фоцитов и NK оценивают их цитотоксическую
Удается выявить: цитокины, ферменты, сигнал-трансдуцирующие молекулы, факторы транскрипции.
С помощью проточной флюориметрии оцениваются также пролиферативная активность (активность клеточного Цикла) и готовность Клеток к апоптозу (по экспрессии CD95).
Косвенным методом оценки функций В-лим-фоцитов является определение уровней иммуноглобулинов четырех классов в сыворотке крови с помощью радиальной иммунодиффузии, нефелометрии или ИФА (табл. 49).
Кожная пробронхиальная астма для оценки гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) является единственным кумулятивным тестом, позволяющим косвенно судить о функциональной активности Т-лимфоцитов в организме человека и напряженности специфического клеточно -
Таблица 49
Некоторые показатели, характфизующие Т - и В-лимфоциты циркулирующей крови человека _(no Janeway Ch. At ak, 1999)_
Стандарты Диагностики Вторичных Иммунодефицитов 569
Активность в отношении определенных клеток-мишеней. Кроме того, оценивают способность лимфоцитов тормозить миграцию макрофагов, способность лимфоцитов продуцировать цитокины.
Существуют три различных подхода к количественному определению цитокинов: иммуно-химический (ИФА ELISA), биотестирование и молекулярно-биологические тесты для выявления мрнк соответствующего цитокина.
Биологическое тестирование — самый чувствительный метод, к тому же единственный, позволяющий получить информацию о биологической активности молекул цитокина. Однако биотесты трудоемки, длительны и недостаточно специфичны, уступая в этих отношениях иммунохимическому подходу (ИФА). Различают четыре разновидности биотестирования: по цитотоксическому эффекту, по индукции пролиферации, по индукции дифференцировки и по противовирусному эффекту. По способности индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование следующих цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. По цитотоксическому действию на чувствительные клетки-мишени (L929) тестируют tnfa и tnfp. Csfs тестируют по способности поддерживать рост костномозговых предшественников в виде колоний в мягком агаре. Ifny тестируют по способности индуцировать экспрессию молекул HLA II на клетках-мишенях. IL-8 тестируют по способности усиливать хемотаксис нейтрофилов.
По противовирусной активности тестируют интерфероны. Биотесты используются больше с исследовательскими целями или для подтверждения результатов ИФА. В любом случае при постановке биотеста необходимо подтверждение принадлежности биологического эффекта определенному цитокину с помощью ингибиции эффекта специфическими моноклональными антителами, нейтрализующими данный цитокин.
Иммуноферментный метод отличается от биотестирования более низкой чувствительностью при высокой специфичности и воспроизводимости. Цитокин выявляется за счет его способности связываться с двумя разными моно-клональными антителами, направленными против двух разных антженныгх эпитопов в молекуле цитокина. Для иммуноферментного определения уровня цитокинов используют стандартные коммерческие наборы. Иммуноцитохимическим методом удается выявить цитокины не только в биологических жидкостях, но и в срезах тканей. Разработана модификация ИФА, позволяющая тестировать отдельные цитокинпродуцирующие
Клетки — ELISPOT. Преимущества ИФА — специфичность, быстрота, простота. Однако этот метод выявляет любую молекулу цитокина, несущую соответствующий антигенный эпитоп независимо от сохранения или утраты ее биологической активности. Способность большинства цитокинов образовывать комплексы с сывороточными белками, присутствие в биологических жидкостях растворимых цитокиновых рецепторов или антагонистов, природных ингибиторов или антицитокиновых антител могут существенно искажать результаты количественного определения уровней цитокинов.
Молекулярно-биологические методы позволяют определить экспрессию цитоки-новых генов в исследуемом материале, т. Е. Присутствие соответствующей мрнк.
Кроме исследования содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических жидкостях дополнительную информацию можно получить при изучении способности клеток к продукции цитокинов.
ИФА используется также при определении уровней содержания в сыворотке крови отдельных компонентов системы комплемента и других белков.
В основе многих иммунопатологических процессов лежат нарушения апоптоза лимфоцитов, в частности, недостаточность апоптоза характерна для аутоиммунных и лимфопролиферативных заболеваний, а при некоторых ИД выявляется повышенная чувствительность лимфоцитов к апоп-тозу. В связи с этим арсенал иммунологических методов, предназначенных для изучения лимфоцитов, за последние годы пополнился методами оценки апоптоза. В частности количество лейкоцитов крови, готовых к апоптозу, оценивают по уровню экспрессии на клеточных мембранах особого маркера CD95 .
Характерными поверхностными маркерами NK считаются CD16 и CD56. С использованием соответствующих моноклональных антител можно определить относительное и абсолютное содержание этих клеток в крови. Для тестирования функциональной активности NK-клеток in vitro общепринято использование чувствительных к их цитолитическому действию перевиваемых клеточных линий, в частности, клеток эритроми-елолейкоза человека — К562. Цитолитическую активность оценивают с помощью предварительной изотопной метки клеток-мишеней.
Изучение системы мононуклеарных фагоцитов человека опирается, в основном, на исследование моноцитов крови, которые у здорового человека составляют от 5 до 10 среди лейкоцитов
Периферической крови. Оценка количества моноцитов крови основывается на данных клинического анализа крови с учетом не только относительного (в ), но и абсолютного числа клеток. Следует подчеркнуть, что при взятии крови из вены в пробу попадают моноциты только циркулирующего пула, в то время как при взятии крови из пальца (капиллярной крови) в пробу могут попасть частично и пристеночные моноциты, с чем, очевидно, связаны разные результаты подсчета количества моноцитов при разных способронхиальная астмах получения крови.
Способность моноцитов прикрепляться к стеклу и пластику используется для их выделения. Вместе с тем адгезивные свойства моноцитов могут изменяться, что позволяет использовать тест адгезии моноцитов к стеклу или пластику для оценки их функциональной активности.
Наиболее точным и информативным является современный метод выявления и количественной оценки экспрессии на мембране моноцитов адгезионных молекул с помощью соответствующих моноклональных антител и метода проточной флюориметрии, который позволяет оценить долю клеток, экспрессирующих ту или иную молекулу адгезии. Таким же методом оценивают поверхностный фенотип моноцита в целом включая экспрессию основных рецепторов, костимулиру-ющих молекул и других антигенов.
В настоящее время используются лабораторные тесты оценки миграционной и хемотаксичес-кой активности моноцитов крови. Для этого используются различные технические модификации: миграции клеток в капиллярах, из капилляров, под агарозой.
Для оценки поглотительной активности моноцитов крови используют биологически инертные, стандартизированные по размеру частицы монодисперсного латекса с диаметром 1,3—1,5 мкм, при этом подсчитывают: процент фагоцитирующих клеток (фагоцитарный показатель) и количество частиц латекса, поглощенных 100 моноцитами (фагоцитарное число). Как правило, у здорового человека фагоцитарной активностью обладают 60-80 свежевыделенных моноцитов крови. В отдельных случаях при оценке фагоцитарной активности моноцитов крови в качестве объектов фагоцитоза используют микроорганизмы — бактерии или дрожжевые клетки (дрожже-подобные грибы рода Candida). Для оценки кис-лородзависимых механизмов внутриклеточной микробицидности моноцитов крови широкое распространение получили косвенные методы, по'июляюшис оценить продукцию супероксидных радикалов: метол учета хемилюминссценции
И тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) .
При дигностике аутоиммунных заболеваний на первое место по значимости выходят методы количественного определения содержания в сыворотке крови и других биологических жидкостях специфических аутоантител к конкретным аутоантигенам. Для этого используется весь современный арсенал иммунологических реакций включая иммунофлуоресцентный и иммунофер-ментный анализ, иммунгистохимию и др. .
При тех же аутоиммунных заболеваниях немаловажно определение уровня содержания в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).
Необходимость, первоочередность и целесообразность включения отдельных тестов в план лабораторного иммунологического исследования оцениваются клиническим иммунологом на основании результатов предшествующего анамнестического и клинического этапов обследования. Результаты иммунологических тестов оцениваются клиническим иммунологом в совокупности и при сопоставлении результатов отдельных тестов. При необходимости назначается дополнительное лабораторное иммунологическое исследование с использованием уточняющих и детализирующих тестов. Клиническая практика показывает, что от тщательности лабораторного иммунологического обследования больного зависит адекватность и эффективность проводимой иммунокорректи-рующей терапии.
При Трактовке результатов иммунологического обследования Следует придерживаться следующих принципов:
1. Комплексный анализ информативнее отдельного показателя.
2. Анализ иммунограммы проводить в комплексе с клинической картиной.
3. Важнейшее значение имеют индивидуальные показатели нормы данного пациента.
4. Для диагностики важны выраженные сдвиги показателей; слабые сдвиги лишь позволяют повысить уверенность в правильности сделанного заключения.
5. Первостепенную практическую значимость имеют соотношения разных популяций и субпопуляций ИКК.
6. Анализ иммунограммы в динамике.
7. Соответствие иммунограммы клинической картине.
8. Анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы диагностического и прогностического характера.