На первом этапе обследования больного необходимо провести долабораторную оценку им­мунного статуса путем анкетирования. Больному задают ряд вопросов. Если хотя бы на один из них он отвечает положительно, это свидетельствует о тех или иных нарушениях в иммунной системе.

1. Частота инфекций. У взрослого человека с нормально функционирующей иммунной систе­мой частота инфекций составляет не более 4 в год (для ребенка — не более 6).

2. Атипичная температурная реакция при наличии инфекции: отсутствие лихорадки (не наблюдается повышения температуры); немо­тивированная лихорадка или длительный субфеб­рилитет — более i 2 сут.

3. Затяжное течение любых заболеваний (бо­лее 3 нед).

4. Наличие у пациента любых хронических за­болеваний.

5. Наличие у пациента любых аллергических реакций.

6. Аутоиммунные заболевания.

7. Онкопатология. Н, Аппсидо - и тонзиллэктомия. 9. Гасфо - и жтеропатии, диарея.

10. Гнойно-септические заболевания (флег­моны, абсцессы, парапроктит и т. П.) И. Повторные лимфоаденопатии.

12. Длительное применение цитостатиков, кортикостероидов, антибиотиков и др. Лекарс­твенных средств, отрицательно влияющих на им­мунную систему.

13. Наличие за последние 6 месяцев травм, ожогов, серьезных операций, стрессов.

По результатам анкетирования можно отдать предпочтение одному из следующих синдромов:

1. Инфекционный синдром — хронический субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии, ре­цидивирующие заболевания легких, частые ОРВИ, бактериальные поражения кожи, поражения ног­тей, рецидивирующие конъюнктивиты, стоматит, кариес, рецидивирующий герпес, лимфоадениты. Дисбактериоз и генерализованная инфекция.

2. Аллергический синдром — аллергопораже-ния кожи и слизистых, дерматиты, экземы, ал­лергические риниты.

3. Аутоиммунный синдром — воспалитель­ные процессы в опорно-двигательном аппарате, СКВ, склеродермия, гломерулонефрит, сахарный диабет, неврологические расстройства, склероз,

Стандарты Диагностики Вторичных Иммунодефицитов 567

Тиреошшт, аутоиммунные поражения печени, бесплодие, психопатические заболевания.

4. Лимфопролиферативный синдром ~- опухо­ли в лимфатической системе, лимфолейкоз, сар­кома Капоши, групповая гиперплазия лимфати­ческих узлов, мононуклеоз и частые увеличения лимфатических узлов.

5. Вторичные иммунодефицита — все виды инфекционного синдрома с торпидным хрони­ческим атипическим течением, гиперпигмента­ция кожи, СПИД.

Если у больного обнаруживаются признаки одного или нескольких синдромов его включают в группу повышенного риска. Таким пациентам требуется помощь клинического иммунолога и иммунологической диагностической лаборатории для уточнения характера иммунных нарушений и обоснованного выбора иммунокорректирующей терапии.

На этапе клинического обследования больно­го используются все методы объективного, инс­трументального и лабораторного обследования, соответствующие характеристикам синдрома, обоснованного результатами анкетирования.

Особое внимание уделяется результатам кли­нического анализа крови, который содержит ин­формацию о количестве циркулирующих в крови лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, т. Е. Ос­новного арсенала клеток, участвующих в иммун­ном ответе и воспалительных реакциях.

При наличии у пациента клинических при_ знаков иммунодефицита необходимо провести лабораторное иммунологическое обследование, результаты которого сводятся в «иммунограмму».

При планировании лабораторного иммуно­логического обследования также исходят из на­иболее вероятного характера иммунологических нарушений, свойственных каждому из вышепе­речисленных синдромов.

Острый бронхитщепринятым объектом изучения являются наиболее доступные лейкоциты циркулирующей крови, которые включают в каждый отдельно взятый момент всего лишь 2 от всех лимфо­цитов организма. Свойственное иммунной сис­теме явление перманентной рециркуляции всех лимфоцитов организма дает основание исполь­зовать лимфоциты крови в качестве типичных представителей всех лимфоцитов организма. Однако следует учитывать, что лимфоциты, как и другие лейкоциты крови, недостаточно полно отражают изменения свойств клеток в очагах ин­фекции, воспаления, деструкции. В связи с этим желательно исследование лейкоцитов не только циркулирующей крови, но и других биологичес­ких жидкостей (ликвор, плевральная жидкость, асцитическая жидкость, бронхо-альвеолярный

Лаваж) или биоптатов пораженных органов и тка­ней.

Для выделения мононуклеаров крови лимфо­цитов и моноцитов наиболее широкое распро­странение получил метод дифференциаль­ного центрифугирования в градиенте плотности. Среди выделенных клеток обычно 70—90 составляют лимфоциты, а на долю моно­цитов приходится от 10 до 30. Использование моноклональных антител позволяет разделить моноциты и лимфоциты с помощью флуоресцен­тно активированного клеточного сортера (FACS). В случаях наиболее выраженного местного иммун­ного ответа лейкоциты могут быть выделены из мест локализации иммунного ответа или иммун­ного воспаления. Например, при ревматоидном артрите наиболее информативным считается изу­чение клеточного состава синовиальной жидкости пораженного сустава.

Наиболее точный и информативный совре­менный метод идентификации лейкоцитов по их поверхностному фенотипу основан на выявлении и количественной оценке уровней экспрессии на мембранах лейкоцитов поверхностных мар­керов-антигенов с помощью соответствующих моноклональных антител и метода проточной цитофлюориметрии. Острый бронхитычный набор изучае­мых поверхностных маркеров включает молеку­лы: CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD16, CD56,

СВ25,Н1А-окидр.

Проточный цитофлюориметр ГС»- Воляет изучить очень большое количество клеток и объективно отразить количественные характе­ристики процентного содержания разных клеток, несущих на поверхности определенные молекулы (табл. 48, 49). Таким методом оценивают поверх­ностный фенотип лейкоцитов включая экспрес­сию основных рецепторов, корецепторов, кос-тимулирующих и адгезионных молекул и других антигенов.

В норме у взрослых около 70 л+имфоцитов крови составляютт-лимфо1гиты (CD3+), среди ко­торых соотношение С04+/СВ8+составляет 1,5-2,0. Остальные 30 приходятся на В-лимфоциты (CD19, CD20) и NK (CD16, CD56).

Изучение поверхностного фенотипа лимфо­цитов позволяет определить соотношения субпо­пуляций Т-лимфоцитов, соотношения наивных клеток и клеток памяти, переход клеток в активи­рованное состояние (CD25f, HLA-DR+).

В дополнение к изучению поверхностного фенотипа проточная флюориметрия позволяет выявлять некоторые молекулы в цитоплазме кле­ток, предварительно обработанных для повыше­ния проницаемости их поверхностной мембраны. В цитоплазме лейкоцитов с помощью этого метода

568 Часть 9. Патология иммунной системы

Таблица 48

Границы нфмальных значений относительного и абсолютного количества лейкоцитов крови, несущих схответствующие поверхностные маркеры у взрослых (по данным ведущих иммунологических лабораторий Санкт - Петербурга, Стандартизация. ..19 99)

Опосредованного иммунитета. Наиболее распро­страненными коммерческими антигенами для постановки кожных проб ГЗТ являются: тубер­кулин, дифтерийный и столбнячный анатокси­ны, кандидозный и некоторые другие антигены. Правильный учет результатов кожной пробы ГЗТ основывается на тщательном измерении диамет­ра зоны уплотнения (а не покраснения) через 24 и 48 ч после внутрикожного введения антигена. Положительной считается пробронхиальная астма в случае, если сумма двух взаимно перпендикулярных диамет­ров зоны уплотнения превосходит 5 мм. Пример­но у 85 здоровых взрослых реакция с одним или несколькими антигенами бывает положительной. Положительная кожная пробронхиальная астма со столбнячным анатоксином бывает у 97 детей после третьей иммунизации вакциной АДС. Проявление поло­жительной реакции вместо отрицательной в ди­намике наблюдения расценивается как «вираж». Положительная реакция при проведении кожных проб позволяет исключить тяжелую недостаточ­ность клеточного иммунитета, а отрицательные результаты реакции не имеют самостоятельного диагностического значения, так как отрицатель­ная реакция может быть следствием отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном.

Для непосредственной оценки функциональ­ной активности Т-лимфоцитов, как правило, оце­нивают спонтанную пролиферацию лимфоцитов и ответ усилением пролиферации на действие митогенов или антигенов. Предпочтение отдается использованию поликлональных митогенов, так как в общей массе лимфоцитов доля лимфоци­тов, способных ответить на конкретный антиген, слишком мала. В качестве поликлональных мито-генов используют эмпирически найденные вещес­тва, способные индуцировать пролиферацию всех или большинства Т-лимфоцитов. В качестве мито-генов Т-лимфоцитов обычно используют фитоге-магглютинин (ФГА) или конканавалин А (кона).

В качестве эффекторных функций Т-лим-фоцитов и NK оценивают их цитотоксическую

Удается выявить: цитокины, ферменты, сигнал-трансдуцирующие молекулы, факторы транс­крипции.

С помощью проточной флюориметрии оцени­ваются также пролиферативная активность (ак­тивность клеточного Цикла) и готовность Клеток к апоптозу (по экспрессии CD95).

Косвенным методом оценки функций В-лим-фоцитов является определение уровней иммуног­лобулинов четырех классов в сыворотке крови с помощью радиальной иммунодиффузии, нефе­лометрии или ИФА (табл. 49).

Кожная пробронхиальная астма для оценки гиперчувс­твительности замедленного типа (ГЗТ) является единственным кумулятивным тестом, позволя­ющим косвенно судить о функциональной ак­тивности Т-лимфоцитов в организме человека и напряженности специфического клеточно -

Таблица 49

Некоторые показатели, характфизующие Т - и В-лимфоциты циркулирующей крови человека _(no Janeway Ch. At ak, 1999)_

Стандарты Диагностики Вторичных Иммунодефицитов 569

Активность в отношении определенных клеток-мишеней. Кроме того, оценивают способность лим­фоцитов тормозить миграцию макрофагов, способ­ность лимфоцитов продуцировать цитокины.

Существуют три различных подхода к коли­чественному определению цитокинов: иммуно-химический (ИФА ELISA), биотестирование и молекулярно-биологические тесты для выявле­ния мрнк соответствующего цитокина.

Биологическое тестирование — са­мый чувствительный метод, к тому же единс­твенный, позволяющий получить информацию о биологической активности молекул цитокина. Однако биотесты трудоемки, длительны и недо­статочно специфичны, уступая в этих отноше­ниях иммунохимическому подходу (ИФА). Раз­личают четыре разновидности биотестирования: по цитотоксическому эффекту, по индукции пролиферации, по индукции дифференцировки и по противовирусному эффекту. По способнос­ти индуцировать пролиферацию чувствительных клеток-мишеней проводят биотестирование сле­дующих цитокинов: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. По цитотоксическому действию на чувстви­тельные клетки-мишени (L929) тестируют tnfa и tnfp. Csfs тестируют по способности подде­рживать рост костномозговых предшественни­ков в виде колоний в мягком агаре. Ifny тести­руют по способности индуцировать экспрессию молекул HLA II на клетках-мишенях. IL-8 тес­тируют по способности усиливать хемотаксис нейтрофилов.

По противовирусной активности тестируют интерфероны. Биотесты используются больше с исследовательскими целями или для подтверж­дения результатов ИФА. В любом случае при постановке биотеста необходимо подтверждение принадлежности биологического эффекта опре­деленному цитокину с помощью ингибиции эф­фекта специфическими моноклональными анти­телами, нейтрализующими данный цитокин.

Иммуноферментный метод отличается от биотестирования более низкой чувствитель­ностью при высокой специфичности и воспро­изводимости. Цитокин выявляется за счет его способности связываться с двумя разными моно-клональными антителами, направленными про­тив двух разных антженныгх эпитопов в молекуле цитокина. Для иммуноферментного определе­ния уровня цитокинов используют стандартные коммерческие наборы. Иммуноцитохимическим методом удается выявить цитокины не только в биологических жидкостях, но и в срезах тканей. Разработана модификация ИФА, позволяющая тестировать отдельные цитокинпродуцирующие

Клетки — ELISPOT. Преимущества ИФА — спе­цифичность, быстрота, простота. Однако этот метод выявляет любую молекулу цитокина, не­сущую соответствующий антигенный эпитоп независимо от сохранения или утраты ее биоло­гической активности. Способность большинства цитокинов образовывать комплексы с сыворо­точными белками, присутствие в биологических жидкостях растворимых цитокиновых рецепто­ров или антагонистов, природных ингибиторов или антицитокиновых антител могут существен­но искажать результаты количественного опреде­ления уровней цитокинов.

Молекулярно-биологические мето­ды позволяют определить экспрессию цитоки-новых генов в исследуемом материале, т. Е. При­сутствие соответствующей мрнк.

Кроме исследования содержания цитокинов в сыворотке крови и других биологических жид­костях дополнительную информацию можно по­лучить при изучении способности клеток к про­дукции цитокинов.

ИФА используется также при определении уровней содержания в сыворотке крови отде­льных компонентов системы комплемента и дру­гих белков.

В основе многих иммунопатологических про­цессов лежат нарушения апоптоза лимфоцитов, в частности, недостаточность апоптоза характерна для аутоиммунных и лимфопролиферативных за­болеваний, а при некоторых ИД выявляется по­вышенная чувствительность лимфоцитов к апоп-тозу. В связи с этим арсенал иммунологических методов, предназначенных для изучения лимфо­цитов, за последние годы пополнился методами оценки апоптоза. В частности количество лейко­цитов крови, готовых к апоптозу, оценивают по уровню экспрессии на клеточных мембранах особого маркера CD95 .

Характерными поверхностными маркерами NK считаются CD16 и CD56. С использованием соответствующих моноклональных антител мож­но определить относительное и абсолютное со­держание этих клеток в крови. Для тестирования функциональной активности NK-клеток in vitro общепринято использование чувствительных к их цитолитическому действию перевиваемых клеточных линий, в частности, клеток эритроми-елолейкоза человека — К562. Цитолитическую активность оценивают с помощью предваритель­ной изотопной метки клеток-мишеней.

Изучение системы мононуклеарных фагоци­тов человека опирается, в основном, на исследо­вание моноцитов крови, которые у здорового че­ловека составляют от 5 до 10 среди лейкоцитов

Периферической крови. Оценка количества мо­ноцитов крови основывается на данных клини­ческого анализа крови с учетом не только отно­сительного (в ), но и абсолютного числа клеток. Следует подчеркнуть, что при взятии крови из вены в пробу попадают моноциты только цирку­лирующего пула, в то время как при взятии крови из пальца (капиллярной крови) в пробу могут по­пасть частично и пристеночные моноциты, с чем, очевидно, связаны разные результаты подсчета количества моноцитов при разных способронхиальная астмах по­лучения крови.

Способность моноцитов прикрепляться к стеклу и пластику используется для их выделения. Вместе с тем адгезивные свойства моноцитов мо­гут изменяться, что позволяет использовать тест адгезии моноцитов к стеклу или пластику для оценки их функциональной активности.

Наиболее точным и информативным является современный метод выявления и количествен­ной оценки экспрессии на мембране моноцитов адгезионных молекул с помощью соответствую­щих моноклональных антител и метода проточ­ной флюориметрии, который позволяет оценить долю клеток, экспрессирующих ту или иную мо­лекулу адгезии. Таким же методом оценивают по­верхностный фенотип моноцита в целом включая экспрессию основных рецепторов, костимулиру-ющих молекул и других антигенов.

В настоящее время используются лаборатор­ные тесты оценки миграционной и хемотаксичес-кой активности моноцитов крови. Для этого ис­пользуются различные технические модификации: миграции клеток в капиллярах, из капилляров, под агарозой.

Для оценки поглотительной активности моно­цитов крови используют биологически инертные, стандартизированные по размеру частицы моно­дисперсного латекса с диаметром 1,3—1,5 мкм, при этом подсчитывают: процент фагоцитиру­ющих клеток (фагоцитарный показатель) и ко­личество частиц латекса, поглощенных 100 мо­ноцитами (фагоцитарное число). Как правило, у здорового человека фагоцитарной активностью обладают 60-80 свежевыделенных моноцитов крови. В отдельных случаях при оценке фагоци­тарной активности моноцитов крови в качестве объектов фагоцитоза используют микроорганиз­мы — бактерии или дрожжевые клетки (дрожже-подобные грибы рода Candida). Для оценки кис-лородзависимых механизмов внутриклеточной микробицидности моноцитов крови широкое распространение получили косвенные методы, по'июляюшис оценить продукцию супероксид­ных радикалов: метол учета хемилюминссценции

И тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) .

При дигностике аутоиммунных заболеваний на первое место по значимости выходят методы количественного определения содержания в сы­воротке крови и других биологических жидкос­тях специфических аутоантител к конкретным аутоантигенам. Для этого используется весь сов­ременный арсенал иммунологических реакций включая иммунофлуоресцентный и иммунофер-ментный анализ, иммунгистохимию и др. .

При тех же аутоиммунных заболеваниях не­маловажно определение уровня содержания в сы­воротке крови циркулирующих иммунных комп­лексов (ЦИК).

Необходимость, первоочередность и целе­сообразность включения отдельных тестов в план лабораторного иммунологического иссле­дования оцениваются клиническим иммуно­логом на основании результатов предшествую­щего анамнестического и клинического этапов обследования. Результаты иммунологических тестов оцениваются клиническим иммуноло­гом в совокупности и при сопоставлении ре­зультатов отдельных тестов. При необходимос­ти назначается дополнительное лабораторное иммунологическое исследование с использо­ванием уточняющих и детализирующих тестов. Клиническая практика показывает, что от тща­тельности лабораторного иммунологического обследования больного зависит адекватность и эффективность проводимой иммунокорректи-рующей терапии.

При Трактовке результатов иммунологическо­го обследования Следует придерживаться следую­щих принципов:

1. Комплексный анализ информативнее от­дельного показателя.

2. Анализ иммунограммы проводить в комп­лексе с клинической картиной.

3. Важнейшее значение имеют индивидуаль­ные показатели нормы данного пациента.

4. Для диагностики важны выраженные сдви­ги показателей; слабые сдвиги лишь позволяют повысить уверенность в правильности сделанно­го заключения.

5. Первостепенную практическую значи­мость имеют соотношения разных популяций и субпопуляций ИКК.

6. Анализ иммунограммы в динамике.

7. Соответствие иммунограммы клинической картине.

8. Анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы диа­гностического и прогностического характера.